Was ist der Unterschied zwischen isothermer Fluoreszenz-PCR und Echtzeit-PCR?

Verstärkungsmethode:

Isotherme Fluoreszenz-PCR: Bei der isothermen Fluoreszenz-PCR erfolgt die DNA-Amplifikation bei einer konstanten Temperatur. Dies bedeutet, dass die Reaktion während des gesamten Prozesses bei einer einzigen, konstanten Temperatur stattfindet.

Echtzeit-PCR: Bei der Echtzeit-PCR, auch quantitative PCR (qPCR) genannt, wird ein thermischer Zyklusprozess verwendet. Es umfasst mehrere Temperaturzyklen, einschließlich Denaturierungs-, Annealing- und Verlängerungsschritten. Diese Temperaturzyklen werden typischerweise von einem Thermocycler gesteuert.

Temperaturkontrolle:

Isotherme Fluoreszenz-PCR: Wie der Name schon sagt, hält die isotherme Fluoreszenz-PCR während der Reaktion eine konstante Temperatur aufrecht, typischerweise etwa 60–65 °C. Dies vereinfacht die für die Reaktion benötigte Ausrüstung im Vergleich zur Echtzeit-PCR.

Echtzeit-PCR: Bei der Echtzeit-PCR handelt es sich um einen thermischen Zyklus, bei dem die Temperatur wiederholt zwischen verschiedenen Niveaus geändert wird (z. B. Denaturierung bei etwa 95 °C, Annealing bei etwa 55–65 °C und Verlängerung bei etwa 72 °C). Dies erfordert einen Thermocycler mit präziser Temperaturregelung.

Erkennungsmethode:

Isotherme Fluoreszenz-PCR: Die Fluoreszenzdetektion wird sowohl bei der isothermen Fluoreszenz-PCR als auch bei der Echtzeit-PCR verwendet. Bei der isothermen Fluoreszenz-PCR werden Fluoreszenzsignale jedoch typischerweise kontinuierlich erfasst, ohne dass zwischen verschiedenen Temperaturschritten gewechselt werden muss.

Echtzeit-PCR: Bei der Echtzeit-PCR werden Fluoreszenzsignale nach jedem Temperaturänderungszyklus gemessen (typischerweise nach dem Annealing-/Verlängerungsschritt). Dies ermöglicht eine Echtzeitüberwachung der DNA-Amplifikation während des Temperaturwechselprozesses.

Anwendungen:

Isotherme Fluoreszenz-PCR: Diese Technik eignet sich für bestimmte Anwendungen, wie z. B. schnelle Point-of-Care-Tests, bei denen Einfachheit und Geschwindigkeit von entscheidender Bedeutung sind. Es kann zum qualitativen Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen verwendet werden.

Echtzeit-PCR: Echtzeit-PCR wird häufig sowohl für die qualitative als auch für die quantitative Analyse von DNA eingesetzt. Es ist hochempfindlich und ermöglicht die Messung der anfänglichen DNA-Menge in einer Probe, was es für Anwendungen wie Genexpressionsanalyse, Quantifizierung der Viruslast und Genotypisierung nützlich macht.

Zusammenfassend besteht der Hauptunterschied zwischen isothermer Fluoreszenz-PCR und Echtzeit-PCR in der Temperaturkontrolle und der Amplifikationsmethode. Die isotherme Fluoreszenz-PCR hält während der gesamten Reaktion eine konstante Temperatur aufrecht und eignet sich für einfachere, schnelle Anwendungen, während die Echtzeit-PCR thermische Zyklen beinhaltet und für ein breites Spektrum quantitativer und qualitativer DNA-Analyseanwendungen verwendet wird.